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磷酸化作用-多肽修飾

磷酸化影響著(zhe)細胞生命的方方面(miàn)面(miàn)。蛋白激酶通過(guò)調節信号通路和細胞進(jìn)程，影響胞内通信功能(néng)的每一方面(miàn)。然而異常的磷酸化也是引起(qǐ)諸多疾病的起(qǐ)因。尤其是突變的蛋白激酶、磷酸酶可導緻許多紊亂。很多天然毒素和病原體也是通過(guò)改變胞内蛋白的磷酸化狀态來發(fā)揮它們的影響。

多肽磷酸化

絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）的磷酸化作用是一個可逆的蛋白修飾過(guò)程，它們參與調節無數的細胞活動，如受體信号轉導、蛋白質締合與分割、激活或抑制蛋白功能(néng)，甚至細胞的存活等。磷酸鹽是帶負電的(每一個磷酸基攜帶兩(liǎng)個負電荷)。因此，他們的加入會改變蛋白屬性，這(zhè)種(zhǒng)變化通常是構象變化，引起(qǐ)蛋白質改變它的構造方式。當磷酸基團被(bèi)去除時，蛋白質構象又會恢複至原始狀态。如果這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)構象的蛋白質表現出不同的活性，那,磷酸化可以作爲此蛋白控制其活性的分子開(kāi)關。

許多激素均是通過(guò)提高絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基的磷酸化狀态來調節特異性酶的活性。生長(cháng)因子（如胰島素）可以觸發(fā)酪氨酸（Tyr）的磷酸化作用。這(zhè)些氨基酸的磷酸基團是可以迅速地被(bèi)去掉的，因此，Ser、Thr和Tyr的功能(néng)在調控細胞活動的過(guò)程（如腫瘤擴散）中起(qǐ)到分子開(kāi)關的作用。

合成(chéng)肽在研究蛋白激酶底物以及相互作用的領域起(qǐ)著(zhe)非常有用的作用。但目前一些因素阻礙或限制了磷酸化多肽合成(chéng)技術的适應性，如無法實現固相合成(chéng)全自動化、缺乏與标準分析平台之間的便利連接等。澤溪源基于PeptideSynTM 平台的多肽合成(chéng)及磷酸化修飾技術克服了這(zhè)些限制，同時提高了的合成(chéng)效率也顯示了它的可擴展性。PeptideSynTM 平台非常适合于蛋白激酶底物、抗原、結合分子和抑制劑的研究。

  • 我們提供pSer、pTyr、pThr和D-pSer、D-pTyr、D-pThr的磷酸化修飾服務。
  • 可同時進(jìn)行2個位點、3個位點、4個位點、5個位點的磷酸化修飾，如：NDEpSpTDYEpSERQpTD。

Peptide modification: phosphorylation

成(chéng)功案例：固相合成(chéng)帶有4個磷酸化位點的多肽

14aa的多肽（MW：1981.53），4個磷酸化位點（xxxpSpTxxxpSxxxpTx），純度爲95%，完成(chéng)周期爲3周。

HPLC Results:

Peptide synthesis: Phosphorylation-HPLC

MS Results:

Peptide synthesis: Phosphorylation-MS

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                        peptide synthesis Quote

檢測蛋白質磷酸化的方法集錦

Radiolabel學(xué)者的研究表明在真核細胞中大約30%的蛋白會經(jīng)受磷酸化作用。一個經(jīng)典的檢測蛋白磷酸化的方法是，二維凝膠電泳或細胞經(jīng)放射性标記32p-正磷酸鹽孵育，提取細胞裂解液，經(jīng)SDS-PAGE作蛋白分離，,然後(hòu)暴光于膠片。這(zhè)些方法不僅需要大量人力，而且需用到放射性同位素。以下簡述了幾種(zhǒng)目前用于檢測磷酸化的方法。

  • 激酶活性檢測

    • 在體外，激酶活性的檢測是將(jiāng)經(jīng)免疫沉澱法獲得的蛋白激酶與某一底物在ATP環境下共同孵育，然後(hòu)再檢測。磷酸化底物的測量可以通過(guò)報告系統如比色法、放射性或熒光檢測而得。

  • 磷酸化特定性抗體的開(kāi)發(fā)

    • 磷酸化抗體已被(bèi)許多研究者使用。澤溪源爲研究人員開(kāi)發(fā)了許多磷酸化特異性抗體。首先合成(chéng)磷酸化多肽，即圍繞靶蛋白磷酸化位點的氨基酸序列，接著(zhe)共轭偶聯至血藍蛋白(KLH)上進(jìn)行免疫。免疫血清將(jiāng)流經(jīng)多肽親和層析柱，從而得到一個非常特異的免疫制劑。檢測的成(chéng)功與否取決于抗體對(duì)靶磷酸化蛋白的特異性和親和力。

  • 免疫印迹（Western Blot）

    • 許多磷酸化抗體是十分敏感的，可以很容易地檢測到常規樣(yàng)品中的磷酸化蛋白。化學(xué)發(fā)光和比色法都(dōu)是較常見的檢測方法，蛋白Markers通常用來爲蛋白質量提供标準。

  • 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

    • ELISAs提供一種(zhǒng)間接測量激酶活性的方法，其比WB更容易定量。磷酸化特異的ELISA技術可以很輕易地通過(guò)使用一個校準标準來量化結果。通過(guò)雙抗體夾心方法，應用兩(liǎng)個靶蛋白的特異性抗體可使檢測呈現高特異性。此外,基于微孔闆的ELISAs檢測，更是具有高通量、微量和對(duì)低豐度蛋白檢測的特點。

  • 細胞ELISA（Cell-Based ELISA）

    • 通過(guò)分析完整的細胞中磷酸化蛋白，可更準确地反應特性的信号網絡狀态。一般磷酸化抗體多通過(guò)熒光或比色法來檢測磷酸化狀态。

  • 流式細胞術(FCM)和ICC / IHC

    • 流式細胞術因其快速、定量、單細胞分析等特點而非常具有優勢。細胞被(bèi)誘導後(hòu)，通過(guò)甲醛或多聚甲醛將(jiāng)其與磷酸化蛋白交聯固定，然後(hòu)分析。固定的細胞需經(jīng)通透處理，以便磷酸化抗體的進(jìn)入。

  • 質譜分析（Mass Spectrometry）

    • 質譜(MS)技術是一項用于識别磷酸化蛋白、磷酸化多肽和磷酸化殘基序列的便利工具。利用MS卓越的靈敏度和分辨率，可識别某一單個蛋白質或多肽。但來自磷酸化多肽的信号通常較弱，因而新的技術正在被(bèi)研發(fā)以增強MS信号。這(zhè)些策略包括固化金屬親和層析，磷酸化抗體的豐富，化學(xué)修飾方法和用生物素部份置換磷酸基團。

  • xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技術

    • Multi-Analyte profiling技術涉及磷酸化抗體的應用和基于微孔闆及膜的檢測方式。這(zhè)些檢測技術可提供大量的數據，卻隻需極少量的樣(yàng)本。然而，這(zhè)些檢測技術并不比傳統的檢測方法敏感，原因在于潛在的抗體交叉反應。

Peptide phosphorylation in bateteria