多肽合成(chéng)：合成(chéng)多肽的處理與保存

1. 我該如何處理和保存多肽？
2. 如何溶解多肽？
3. 是否可以預測一個肽段是可溶的？
4. 如何選擇适合自己研究的多肽純度？
5. 什麼(me)是多肽的純度？
6. 什麼(me)是肽淨含量？
7. 應該如何選擇多肽的鹽形式？
8. 如何合成(chéng)多肽？
9. 澤溪源如何對(duì)我的多肽進(jìn)行質檢？
10. 公司對(duì)合成(chéng)的多肽提供分裝服務嗎？
11. 什麼(me)是原料藥（APIs）、目錄肽（catalog peptides）、合成(chéng)肽（custom peptide synthesis）？
12. 單個訂單的最少合成(chéng)量是多少？
13. 澤溪源能(néng)夠合成(chéng)的多肽的最大長(cháng)度是多少？
14. 什麼(me)是固相合成(chéng)？
15. 什麼(me)是樹脂和鏈接劑
16. 什麼(me)是保護基團？
17. 什麼(me)是N端乙酰化、C端酰胺化修飾？
18. 熒光标記時，肽和修飾标記的染料之間是否需要添加一個間隔？
19. 怎樣(yàng)計算多肽的濃度?
20. 如何利用SDS-PAGE法去除小的多肽？
21. 如何將(jiāng)多肽溶解在DMSO中？

1. 我該如何處理和保存多肽？

凍幹粉形式的多肽，經(jīng)密封包裝可在常溫條件下穩定運輸，溶解狀态的多肽不宜長(cháng)期保存。

多肽保存指南：需要長(cháng)期保存的多肽，應以凍幹粉形式存放在含有幹燥劑的密封容器内，置于-20°C保存，-80°C效果更好(hǎo)，可以最大限度地避免多肽降解。這(zhè)種(zhǒng)儲存方式可以使多肽可保存數年，避免了被(bèi)細菌降解和氧化，也可以避免二級結構的形成(chéng)。

打開(kāi)包裝： 在打開(kāi)包裝和稱重前，請先將(jiāng)多肽在幹燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性，未經(jīng)平衡到室溫的多肽在打開(kāi)蓋子後(hòu)易凝結，從而降低了多肽産品的穩定性。

稱重： 迅速稱取您所需的多肽，并將(jiāng)剩餘多肽繼續儲存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

2. 如何溶解多肽？

多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性的蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機溶劑中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然後(hòu)加水（蒸餾水）稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能(néng)用DMSO溶解，因爲DMSO可能(néng)造成(chéng)側鏈氧化。

多肽溶解測試： 在多肽溶解之前先取小部分進(jìn)行多肽溶解測試，您需要測試幾種(zhǒng)不同的溶劑，直到找到最适當的一種(zhǒng)。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。（注意: 超聲處理會引起(qǐ)溶液發(fā)熱和多肽降解。）

1. 將(jiāng)每個酸性氨基酸賦值爲－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每個堿性氨基酸賦值爲＋1，包括精氨酸（R）、賴氨酸（K）、組氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然後(hòu)計算整個多肽的電荷數。
2. 如果整段肽所帶電荷是陽性的，說明該肽是堿性的。可先嘗試用蒸餾水來溶解；如果不溶于水，接著(zhe)嘗試用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，添加一些TFA（10-50微升）來增溶，然後(hòu)用水稀釋至理想濃度。
3. 如果整段肽所帶電荷是陰性的，說明該肽是酸性的。酸性的多肽可以嘗試用PBS（PH 7.4）來溶解，如果不溶的話，添加少量的堿性溶劑，如0.1 M的碳酸氫铵，然後(hòu)加水稀釋至理想濃度。含有遊離半胱氨酸的多肽應溶于脫氣的酸性緩沖液中，因爲當PH值大于7時，巯基會被(bèi)迅速氧化成(chéng)二硫化物。
4. 如果整段肽電荷是零，說明肽是中性的。中性肽通常溶于有機溶劑。首先，嘗試添加少量乙腈、甲醇或異丙醇。對(duì)于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亞砜溶解，然後(hòu)用水稀釋至理想濃度。對(duì)于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。對(duì)于有聚集傾向(xiàng)的肽，可添加6M鹽酸胍或8M尿素，然後(hòu)進(jìn)行必要的稀釋。

爲了防止或盡量減少多肽降解，請將(jiāng)多肽以凍幹粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好(hǎo)分成(chéng)小樣(yàng)存放，以避免反複凍融。一份樣(yàng)品融凍後(hòu)未用完，應扔掉。細菌降解有時會成(chéng)爲溶液肽的麻煩，所以請將(jiāng)肽溶于無菌水或肽溶液過(guò)濾除菌。

堿性氨基酸: K, R, H, N-terminus
酸性氨基酸: D, E, C-terminus
極性中性氨基酸: F, I, L, M, V, W, Y
非極性疏水氨基酸: G, A, S, T, C, N, Q, P, 乙酰基，酰胺基

舉例說明：
RKDEFILGASRHD: (+5) + (-4) = +1 認爲是堿性多肽，見步驟2
EKDEFILGASEHR: (+4) + (-5) = -1 認爲是酸性多肽，見步驟3
AKDEFILGASEHR: (+4) + (-4) = 0 認爲是中性多肽，見步驟4

3.一個肽段是否可溶能(néng)預測嗎？

我們無法通過(guò)研究多肽的結構來預測其在水中的溶解度。然而，賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于預測溶解度，尤其是短肽。與此相反，含有天門冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或堿性緩沖液。

4. 如何選擇适合自己研究的多肽純度？

粗品肽不推薦用于生物實驗。粗肽可能(néng)含有大量的非肽類雜質，如殘留的有機溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能(néng)被(bèi)完全消除，通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘留的TFA影響您的實驗，我們推薦其他鹽形式，如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這(zhè)些鹽通常比常規TFA鹽貴20-30%以上。這(zhè)是由于在轉化過(guò)程中出現更多的肽損失和需要更多的原材料。

LifeTein建議對(duì)各種(zhǒng)項目采用以下級别的肽純度：

>70% 肽純度

• 肽微陣列
• 作爲制備抗體的抗原
• 層析法
• 酶聯免疫吸附試驗檢測抗血清滴度

>80% 肽純度

• 免疫印迹法（非定量）
• 酶底物肽（非定量）
• 封閉肽（非定量）
• 親和純化
• 磷酸化檢測
• 蛋白電泳的應用和免疫細胞化學(xué)

>95% 肽純度

• 标準酶聯免疫吸附試驗和RIA（定量）
• 受體配體相互作用（定量）
• 體内、體外 生物學(xué)測定
• 酶的研究和阻斷實驗（定量）
• NMR研究
• 質譜分析
• 其他定量檢測

>98% 肽純度

• SAR研究
• 臨床試驗
• APIs(藥物活性成(chéng)分)
• 工業品
• X-ray晶體研究
• 其他敏感的實驗：酶與底物、受體與配體相互作用、阻斷和競争實驗

5. 什麼(me)是多肽的純度？

多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測到的目标多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長(cháng))，紫外分光光度計檢測不到水和殘留的鹽不。可發(fā)現其他的雜質包括：缺失序列（缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列），截斷序列（加帽過(guò)程中産生的序列）脫保護不完全序列（産生于整個合成(chéng)過(guò)程或最後(hòu)的裂解過(guò)程）。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會産生少量的TFA，如：遊離的氨基末端和其他側鏈如Arg、Lys、His都(dōu)可生成(chéng)少量TFA雜質。通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍幹狀态，水也會因共價結合的能(néng)力不同而不同程度地存在著(zhe)。

在多肽中還(hái)存在哪些其他物質(雜質)?

純化前的多肽中包含的雜質包括多肽和非多肽物質, 純化後(hòu)的多肽中包含的雜質除了TFA鹽，大多數爲序列被(bèi)修改的多肽。

1. 缺失了一個或多個氨基酸殘基的靶序列
2. 爲避免缺失序列的産生而進(jìn)行的加帽操作，截斷序列即産生于加帽過(guò)程中
3. 産生于整個合成(chéng)過(guò)程或最後(hòu)的裂解過(guò)程
4. 保護基重新附著(zhe)在多肽的其他位置

6. 什麼(me)是肽淨含量？

肽淨含量不同于多肽純度。肽淨含量是指與非肽物質（主要爲抗衡離子和水）相比的多肽量。可通過(guò)氨基酸分析來确定肽淨含量。如果您需要這(zhè)項服務請在訂單上明确。通常，親水性多肽即使在嚴格的凍幹狀态下，也會吸收微量的水。因純化和凍幹工藝，會導緻不同批次的肽淨含量有所不同。

7. 如何合成(chéng)多肽？

不同于天然蛋白質的合成(chéng)，人工合成(chéng)的方向(xiàng)是從C到N端。澤溪源的多肽合成(chéng)是基于PeptideSyn技術平台的Fmoc或t-Boc法的多肽合成(chéng)。具體合成(chéng)由下列幾個循環組成(chéng)：①去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用piperidine去除氨基的保護基團。②激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被(bèi)一種(zhǒng)活化劑所活化。活化的單體與遊離的氨基反應交聯，形成(chéng)肽鍵。③循環：這(zhè)兩(liǎng)步反應反複循環直到合成(chéng)完成(chéng)。接著(zhe)合成(chéng)的肽從樹脂切割和去保護。最後(hòu)被(bèi)沉澱、洗脫、冷凍幹燥。

7.What salt form should I use?

Peptides are usually delivered as TFA salts. If residual TFA would be problematic for your experiment, we recommend other salt forms such as acetate and hydrochloride. These salt forms are usually 20-30% more expensive than the regular TFA salt because of the peptide loss that takes place during the salt conversion and the greater amounts of raw materials required.

8. 如何合成(chéng)多肽？

不同于天然蛋白質的合成(chéng)，人工合成(chéng)的方向(xiàng)是從C到N端。澤溪源的多肽合成(chéng)是基于PeptideSyn技術平台的Fmoc或t-Boc法的多肽合成(chéng)。具體合成(chéng)由下列幾個循環組成(chéng)：①去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用piperidine去除氨基的保護基團。②激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被(bèi)一種(zhǒng)活化劑所活化。活化的單體與遊離的氨基反應交聯，形成(chéng)肽鍵。③循環：這(zhè)兩(liǎng)步反應反複循環直到合成(chéng)完成(chéng)。接著(zhe)合成(chéng)的肽從樹脂切割和去保護。最後(hòu)被(bèi)沉澱、洗脫、冷凍幹燥。

9. 澤溪源如何對(duì)合成(chéng)的多肽進(jìn)行質檢？

公司對(duì)客戶提供的所有材料均嚴格保密。澤溪源總是在發(fā)送産品時，同時免費提供HPLC和MS檢測結果。公司所有多肽均采用反相色譜法純化。以質譜法測定肽的分子量來确定産品是否正确，MS檢測結果還(hái)可顯示大部份的主要雜質。如果必要，還(hái)可提供肽淨含量檢測，如氨基酸分析或元素分析。這(zhè)些方法可以證實多肽的氨基酸組成(chéng)，他們均可作爲多肽确認的補充方法。所有交付的肽均達到了客戶要求的純度。沒(méi)有達到純度要求的那些多肽均被(bèi)丢棄。當然如果客戶需要，也可以發(fā)送給他們。

10. 公司對(duì)合成(chéng)的多肽提供分裝服務嗎？

根據要求，澤溪源可以將(jiāng)您的部分或全部訂單，免費分裝成(chéng)小份。由于少量分裝可以避免多次反複凍融，減少容器的開(kāi)蓋和閉合的次數，減少處理不當或細菌污染的機會，讓您的多肽更加穩定。

11. 什麼(me)是原料藥（APIs）、目錄肽（catalog peptides）、合成(chéng)肽（custom peptide synthesis）？

原料藥（活性藥物成(chéng)分）是醫藥中具有藥物活性的成(chéng)分，如縮宮素、恩夫韋地等。目錄肽是市場上銷售的多肽，他們通常以較高的純度水平批量生産。合成(chéng)肽通常是根據客戶的具體要求定制，如特定序列、修飾、不同純度、不同長(cháng)度等要求。公司提供的API肽合成(chéng)周期爲2-3周。

12. 單個訂單的最少合成(chéng)量是多少？

公司提供的單條訂單的最少合成(chéng)量是1mg，用于研究的多肽和GMP藥物肽合成(chéng)的量在澤溪源沒(méi)有上限。

13. 澤溪源能(néng)夠合成(chéng)的多肽的最大長(cháng)度是多少？

澤溪源成(chéng)功合成(chéng)了長(cháng)度爲120個氨基酸的多肽。 50個氨基酸長(cháng)度的多肽屬于常規合成(chéng)。

14. 什麼(me)是固相合成(chéng)？

氯甲基聚苯乙烯樹脂作爲不溶性的固相載體，首先將(jiāng)一個氨基被(bèi)封閉基團保護的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護基，這(zhè)樣(yàng)第一個氨基酸就接到了固相載體上了。然後(hòu)氨基被(bèi)封閉的第二個氨基酸的羧基通過(guò)N,Nˊ-二環己基碳二亞胺（DCC，Dicyclohexylcarbodiimide）活化，羧基被(bèi)DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成(chéng)肽鍵，形成(chéng)二肽。重複上述肽鍵形成(chéng)反應，使肽鏈從C端向(xiàng)N端延長(cháng)，直至達到所需要的肽鏈長(cháng)度。

15. 什麼(me)是樹脂和鏈接劑?

樹脂是一種(zhǒng)以聚苯乙烯等爲基質的聚合物支架，是人工合成(chéng)的固相介質。不同的樹脂有不同的特性。如聚乙二醇在非極性溶劑中膨脹，而聚苯乙烯在極性和非極性溶劑中都(dōu)膨脹。鏈接劑是鏈接樹脂支架與基質的中間結構。不同的鏈接劑，适用于基質中的不同功能(néng)團。

16. 什麼(me)是保護基團？

保護基團是能(néng)夠結合功能(néng)基團并阻斷其反應活性的片段。有些是acid-labile保護基團，如Boc和tert-Bu酯類物質。有些是base labile保護基團，如Fmoc和Fm酯類物質。還(hái)有一些是fluoride-labile保護基團，如Tmsec和Tmse酯類物質。爲确保羧基和氨基間的有效耦合，保護基團應該易于被(bèi)附加和去保護，且不影響其它肽段。

17. 爲什麼(me)要進(jìn)行N端乙酰化，C端酰胺化修飾？

化學(xué)合成(chéng)的肽往往攜帶遊離的氨基和遊離的羧基。而肽的序列往往代表了母本蛋白的序列，爲了與母本蛋白更爲接近，肽末端往往需要封閉，即N端乙酰化和C端酰胺化，這(zhè)些修飾會減少多肽的總電荷，降低多肽的溶解度，也可以使肽模拟它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀态。

如果需要對(duì)N端進(jìn)行乙酰化修飾或對(duì)C端進(jìn)行酰胺化修飾，請在下單時明确。合成(chéng)一旦結束，則不能(néng)再進(jìn)行修改。

18. 熒光标記時，肽和修飾标記的染料之間需要加一個間隔嗎？

多數染料屬于大分子量芳香族氨基酸，在多肽中引入這(zhè)一類大型分子，爲了避免多肽與标簽之間發(fā)生相互作用，維持蛋白的構象及其生物學(xué)活性，我們推薦引入一個可彎曲的間隔區，比如Ahx, Ahx是一個含有6碳分子的環狀結構，可以維持熒光标簽的穩定性。否則，FITC很容易結合多肽序列中的半胱氨酸殘基或者賴氨酸殘基。

通常情況下，生物素、FITC一類的染料既可以标記在蛋白的氨基端也可以标記在蛋白的羧基端。然而，爲了在最短時間内，最便捷又高效地合成(chéng)多肽，澤溪源推薦客戶選擇标記在氨基端。因爲一個多肽的合成(chéng)往往是從羧基端開(kāi)始的，這(zhè)樣(yàng)一來，氨基端的修飾便成(chéng)爲最後(hòu)一個環節，不需要再進(jìn)行特别的結合作用。反之，羧基端修飾需要額外的環節，因此過(guò)程更加複雜。

19. 怎樣(yàng)計算多肽的濃度？

Peptide Purity is the percentage target sequence amongst the total quantity of peptides. Because peptide bond formation in synthesis is not 100% efficient, not all polypeptide chains are the target sequence. Some chains may not go to completion, or amino acids may not properly bond on certain chains. These deleted sequences make up a certain percentage of peptides in your mixture. We analyze and purify crude peptides using Reverse Phase HPLC in conjunction with Mass Spec Analysis to attain the desired target sequence purity.

After your peptide is purified and lyophilized, the white peptide powder will contain some non-peptide components such as water, absorbed solvents, counter ions and salts. Net peptide content consists of the actual percentage weight of peptide in your final product. This number varies, anywhere from 50 to 90 percent, depending on the purity, sequence and method of synthesis and purification. When calculating the concentration of peptide solution for biological assays or other sensitive peptide experiments, it is essential that you account for peptide content. Peptide concentrations can be determined by subtracting away the non-peptide weight determining the volume of solvent in which to dissolve. For example, when using 1mg of final product to make a 1mg/ml solution of peptide with a content of 80%, you would use 800ul of solvent instead of 1000ul.

Peptide content is not an indication of peptide purity; these are two measurements. Purity is determined by HPLC and indicates the presence/absence of contaminating peptides with undesired sequences. Net peptide content only gives information on the percent of total peptide versus total non-peptide components independently of the presence of multiple peptides. Net peptide content is accurately found by performing amino acid analysis or UV spectrophotometry.

It is difficult to determine the actual peptide concentration based on the weight of the lyophilized peptide. Lyophilized peptides may contain 10-70% water and salts by weight. More hydrophilic peptides generally contain more bound water and salts compared to hydrophobic peptides.

If the peptide has a chromophore in the sequence (W or Y residues), peptide concentration can be conveniently determined based on the extinction coefficient of these residues.

The following steps can be used for the calculations:

1. Molar extinction coefficients of chromophoric residues at 280 nm at neutral pH using a 1-cm cell:
   • Tryptophan 5560 AU/mmole/ml
   • Tyrosine 1200 AU/mmole/ml
2. The extinction coefficient of each chromophore in the peptide sequence is generally considered to be additive, that is, the overall molar extinction coefficient of the peptide depends on the types and number of these choromophoric residues in the sequence.
3. Calculations: mg peptide per ml = (A280 x DF x MW) / e, where A280 is the actual absorbance of the solution at 280 nm in a 1-cm cell, DF is the dilution factor, MW is the molecular weight of the peptide and e is the molar extinction coefficient of each chromophore at 280 nm
4. Hypothetical example: A 50X diluted solution of a peptide with the sequence GRKKRRQRRRPPQQ (MW = 1847) reads 0.5 AU at 280 nm in a 1-cm cell. To calculate the original peptide concentration in the stock peptide solution:
   Mg peptide/ml = (0.5AU x 50 x 1847 mg/mmole) / [(1 x 5560) + (2 x 1200)] AU/mmole/ml = 5.8
5. Cautions:

• Any absorbance calculation assumes that the peptide is unfolded and the chromophores are exposed, which is usually the case in short, soluble peptides. If there are doubts about the solubility or the folding of the peptide, it is advisable to make the measurement under denaturing conditions (e.g., 6M GdnHCl or 8M urea). Obviously, these peptide solutions will be rendered useless, unless the denaturants are removed.
• If the sequence does not have Trp or Tyr, the only practical option is to do amino acid analysis.

20. 如何利用SDS-PAGE法去除小的多肽？

您的樣(yàng)品中是否含有<20 kDa的目标蛋白？ 請點擊下載關于 用SDS-PAGE法去除小分子合成(chéng)肽的方案。Tricine-SDS-PAGE方案其中包括考瑪斯亮藍染色和電泳的實驗方法。

Tricine-SDS-PAGE被(bèi)普遍用于分離分子量爲1-100 kDa的蛋白，它被(bèi)認爲是分辨<30 kDa蛋白的首選電泳系統。

21. 如何將(jiāng)多肽溶解在DMSO中？

二甲基亞砜（DMSO）是一種(zhǒng)含硫有機化合物，分子式爲（CH3)2SO，常溫下爲無色無臭的透明液體。DMSO作爲冷凍保護劑經(jīng)常應用于細胞庫。在細胞冷凍過(guò)程中，DMSO可防止胞内/胞外晶體的形成(chéng)，其工作濃度爲10%。DMSO通常可與鹽或血清白蛋白結合。

疏水性多肽可以很容易地溶解在DMSO中。但DMSO可增加細胞的通透性，若多肽溶解于DMSO中則會對(duì)細胞産生毒性作用。高濃度的DMSO絕不可應用于細胞培養中。濃度爲5%的DMSO即可讓細胞膜溶解。大多數細胞株可以容忍0.5% DMSO，少許可以容忍1%的濃度，而不表現出嚴重的細胞毒性。然而原代細胞培養對(duì)其更敏感。所以如果是用原代細胞做劑量/反應曲線(可行性)，其濃度應低于0.1%。

對(duì)于某些疏水性非常高的多肽，可先嘗試將(jiāng)其溶解在少量的DMSO(30-50ul,100%)中，然後(hòu)慢慢 (一滴一滴地)將(jiāng)其添加到不斷攪拌的水溶液如PBS或其他想要的緩沖液中，直至理想濃度。如果滴加過(guò)程中，肽溶液開(kāi)始變渾濁，說明已經(jīng)達到了溶解極限。另外，超聲波有助于多肽溶解。

經(jīng)驗:

• 對(duì)幾乎所有的細胞來說，濃度爲0.1%DMSO是安全的。
• 廣泛被(bèi)用于細胞培養的DMSO終濃度爲0.5%，不會引起(qǐ)細胞毒性。
• 雖然對(duì)部份細胞來說，1%DMSO也不會産生細胞毒性，但我們推薦0.5%。
• 也有5%DMSO成(chéng)功地應用于某些細胞的案例。
• 始終保持終濃度在0.5%，但儲存時可200倍高濃度溶于100%的DMSO中。