多肽和蛋白的相互作用

檢測與某一多肽相互作用的物質，最簡單的方法就是利用此多肽做親和pull-down實驗，然後(hòu)直接檢測結合蛋白。蛋白質體外結合(Pull-down)試驗可用于驗證蛋白-蛋白相互作用的存在（經(jīng)由别的研究方法預測過(guò)的，如免疫共沉澱）和作爲一種(zhǒng)初級的篩選試驗來識别一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通過(guò)競争性阻斷結合，合成(chéng)肽通常被(bèi)用來驗證被(bèi)假設的蛋白質-蛋白質相互作用。

生物素标記肽含有一個特殊的功能(néng)區和相當于參照的未修飾肽，此肽可被(bèi)錨定在親和素共轭的磁珠上，將(jiāng)這(zhè)些磁珠與目标樣(yàng)本共同孵育（如核提取物或純化的重組蛋白），通過(guò)洗滌去除未結合的蛋白，然後(hòu)洗脫結合的蛋白質， SDS/ PAGE分析，經(jīng)蛋白染色即可直接觀察。通過(guò)比較分别與修飾和未修飾多肽相結合的蛋白質，即有可能(néng)确定候選者，即特定功能(néng)蛋白的“reader”蛋白。

帶有一些特殊修飾的生物素标記肽可以通過(guò)化學(xué)合成(chéng)，純度達80％以上。肽長(cháng)度應該在15-20個氨基酸。目标修飾位于序列中間時，兩(liǎng)翼氨基酸殘基不能(néng)少于6-8個。一般情況下，生物素多被(bèi)偶聯在N末端或C末端。如果無特殊要求，我們建議生物素偶聯至N-末端，其優勢是修飾的成(chéng)功率更高，生産的時間更短，并且易于操作。此外，如果偶聯至C-末端，需要額外增加一個賴氨酸。

生物素标記肽的Pull-down實驗方案

生物素标記肽可與親和素磁珠共轭以生成(chéng)樹脂，用于肽pulldown試驗。先把生物素标記肽上樣(yàng)至Immobilized streptavidin beads (Pierce) 錨定有親和素的磁珠上，再與細胞裂解液孵育。細胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作爲磷酸酶抑制劑。等量的蛋白質分别與被(bèi)錨定的多肽在4℃孵育6小時。經(jīng)過(guò)大量洗滌，在SDS樣(yàng)品buffer中煮沸，結合蛋白可從被(bèi)錨定的多肽洗脫下來，或者，用50 mM dithiothreitol將(jiāng)多肽與蛋白複合物從磁珠中斷開(kāi)。將(jiāng)來自活性肽和對(duì)照目标肽pull-downs的洗脫液合并，以作進(jìn)一步的分析。

上圖爲鏈黴親和素-生物素鍵力測量示意圖。由于它們異常高的親和結合性，其中最突出的配體-受體對(duì)是鏈黴親和素-生物素（streptavidin-biotin）和親和素-生物素（avidin-biotin）。 這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)蛋白質都(dōu)有一個四聚體的結構，這(zhè)樣(yàng)他們可以結合4個配體。

肽結合特性

hsp70（相對(duì)分子質量爲70K的熱休克蛋白）僅可識别未折疊蛋白。爲了研究蛋白相互作用中每個氨基酸的偏好(hǎo)，Gregory C. Flynn等學(xué)者用人工合成(chéng)的随機序列多肽去替代免疫球蛋白結合蛋白質（BiP）的結合位點。結果發(fā)現，BiP的結合位點表現出相當大的特異性。

• 多肽長(cháng)度：7個氨基酸的多肽與hsp70家族結合的最好(hǎo)。通常6-10個氨基酸的多肽即可很好(hǎo)地結合。增加多肽的長(cháng)度并不能(néng)增加其結合的特異性。


• 氨基酸偏好(hǎo)：能(néng)夠與BiP複合物結合的多肽鏈普遍顯示含有豐富的脂肪族氨基酸，如甘氨酸（Glycine）、（Alanine）、缬氨酸（Valine）、亮氨酸（Leucine）、異亮氨酸（Isoleucine）和脯氨酸（Proline）。


• 在BIP複合物中含量最豐富的是亮氨酸（Leucine），說明亮氨酸在蛋白結合中的重要作用。
• 無支鏈的氨基酸（如蛋氨酸（Methionine））和支鏈遠離主幹的氨基酸（如亮氨酸（Leucine））往往傾向(xiàng)于與BiP結合。這(zhè)可能(néng)是因爲側鏈的靈活性和疏水性有利于結合。
• 即使具有最強的疏水性，但由于芳香族類氨基酸（苯丙氨酸（Phenylalanine）、酪氨酸（Tyrosine）、色氨酸(Tryptophan)）不具有靈活的側鏈，因而對(duì)結合來說并不太重要。
• 任意含1.6個脂肪族氨基酸殘基的7肽勻可高效與BiP結合。

參考文獻: Gregory C. Flynn, Jan Pohl, Mark T. Flocco & James E. Rothman. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP. 24 October 1991, Nature 353, 726-730 doi:10.1038/353726a0.