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細胞穿膜肽合成(chéng)
穿透細胞膜進(jìn)入細胞内是許多作用靶點在細胞内的生物大分子發(fā)揮作用的先決條件，然而生物膜的生物屏障作用阻止了許多高分子物質進(jìn)入細胞内，從而很大程度地限制了這(zhè)些物質在治療領域的應用。因此，如何引導這(zhè)些物質穿透細胞膜是一個迫切需要解決的問題，目前介導生物大分子穿透細胞膜的方法主要包括細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）、脂質體、腺病毒、納米顆粒、影細胞等，而CPPs是一類以非受體依賴方式，非經(jīng)典内吞方式直接穿過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞的多肽，它們的長(cháng)度一般不超過(guò)30個氨基酸且富含堿性氨基酸，氨基酸序列通常帶正電荷。
1型人免疫缺陷病毒轉錄激活因子TAT（human immunodeficiency virus-1 transcription activator， HIV-1 TAT）是第一個被(bèi)發(fā)現的細胞穿透肽，它憑借一種(zhǒng)無毒的、高效的方式進(jìn)入細胞。
細胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）的一個重要特點是可以攜帶多種(zhǒng)不同大小和性質的生物活性物質進(jìn)入細胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸（peptide nucleo acid, PNA）、蛋白質、質粒DNA、siRNA、200nm的脂質體、噬菌體顆粒和超順磁性粒子等，這(zhè)一性質爲其成(chéng)爲靶向(xiàng)藥物的良好(hǎo)載體提供了可能(néng)。CPPs作爲載體的優勢在于低毒性和無細胞類型的限制，盡管CPPs可輸送不同類型的物質進(jìn)入細胞，但其實際應用多集中于寡肽、蛋白質、寡聚核苷（oligonucleotides，ONs)或類似物的細胞轉運。
- CPP–oligonucleotides
- 跨膜機制
- CPPs序列
- HIV-1 TAT
CPPs 多肽合成(chéng)修飾:
CPP作爲有效的基因轉運載體，其與寡聚核苷的連接是以非共價形式連接。而非共價連接方法比較簡單，僅有賴于CPP和外源物質按一定比例混合。非共價複合物通過(guò)胞漿膜後(hòu)，在細胞内部解離，釋放物質到達細胞靶位。
簡單的混合方法:
Example: For MPG mediated gene delivery, peptide carrier/DNA complexes were formed in DMEM or phosphate-buffered saline (500 ml of DMEM containing 100 ng of DNA complexed with MPG at a charge ratio of 5:1) and incubated for 30 min at 37°C. Cells grown to 60% confluence were then overlaid with these preformed complexes.
CPPs與寡聚核苷形成(chéng)的納米複合物在血清蛋白存在的環境下也不會分離，與目前市售的陽離子型的脂質體相比，CPPs有更高的細胞轉染效率。
許多新型的CPPs被(bèi)證實憑借一種(zhǒng)無毒的方式轉染各種(zhǒng)類型細胞，并在胞内産生明顯的生物學(xué)反應。體内實驗表明，CPPs介導的寡聚核苷可有效地抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(cháng)，而且不會激發(fā)體内的免疫反應，彰顯了CPP-ON複合物在基因治療領域的希望和巨大潛力。其優勢在于入胞速度快，轉導效率高，生理狀态下穩定、無毒、無免疫性等。
表1: CPP介導siRNA（非共價連接）的應用與效果
CPP |
細胞類型 |
效果 |
參考文獻 |
MPG
ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cys
The cysteamide stabilises the carrier/DNA particle, as similarly reported for gene delivery mediated by cysteine-containing peptides. |
HeLa,Cos-7
HS68, NIH-3T3 |
Cellular uptake of single- and double-stranded ONs
50 nmol/l siRNA→85% and 78% luciferase
downregulation |
Simeoni et al. |
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HS68 |
100 nmol/l siRNA→60% GAPDH downregulation |
Simeoni et al. |
MPGΔNLS
ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cys |
HeLa, Cos-7 |
50 nmol/l siRNA→95% and 90% luciferase
downregulation |
Simeoni et al. |
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Stearyl-R8
st-RRRRRRRR-NH2
Polyarginine peptides, which are very efficient CPPs have been used for siRNA delivery into cells.
Stearylated octaarginine (Stearyl-R8), are able to encapsulate and shuttle nucleic acids through cell membranes without the need to covalently attach the nucleic acid to the arginine-containing carrier peptide. |
EGFP-expressing
hippocampal neurons |
16 nmol/l siRNA→>50% reduction in EGFP activity |
Tönges et al. |
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EB1
LIKLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-amide |
HeLa, HepG2 |
Luciferase downregulation |
Lundberg et al. |
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Tat-DRBD
GRKKRRQRRRPQ-DRBD |
H1299, HUVEC, Jurkat T,
hESC |
>90% reduction in GAPDH mRNA level |
Eguchi et al. |
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PF6
St-AGYLLGK[kk2sa4qn4]INLKALAALAKKIL-NH2
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Hepatoma, MEF,
HUVEC, mESC |
Significant downregulation of HPRT1 |
El-Andaloussi
et al. |
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不同的細胞穿透肽（CPP）跨膜機制不同，一個細胞穿透肽（CPP）的具體機制有賴于幾個參數，如分子大小（攜帶物質）、溫度、細胞類型和細胞内外的穩定性等。細胞穿透肽（CPP）進(jìn)入細胞的具體機制目前還(hái)不清楚，比較流行的推測包括以下三種(zhǒng)：
- A: 倒置膠粒模型（inverted micelle model），CPPs通過(guò)細胞膜上磷脂分子的移動形成(chéng)倒置膠粒結構，而進(jìn)入胞漿。
- B: 直接穿透，即孔隙結構模型 (pore formation model)，CPPs在細胞膜上組成(chéng)跨膜的孔隙結構而進(jìn)入胞漿 。
- C: 内吞方式進(jìn)行細胞攝取。
來源: Cell-penetrating peptides and their therapeutic applications, Victoria Sebbage, BioscienceHorizons, Volume 2, Number 1, March 2009.
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自從細胞穿透肽Tat的發(fā)現，細胞穿透肽的數量也在不斷地增加。以下表格列舉了部份已知的細胞穿透肽（CPPs），以及它們的來源和詳細的序列信息。
| 名稱 |
來源 |
序列 |
| Tat (48-60) |
HIV-1 protein |
GRKKRRQRRRPPQQ |
| Oligoarginine |
Tat derivative |
Rn |
| plsl |
Igl-1 homeodomain |
RVIRVWFQNKRCKDKK |
| Transportan |
Galanin-mastoparan |
GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL |
| P-alpha |
gp41-SV40 |
GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRRV |
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Stearyl-R8 |
Stearly-RRRRRRRR-amide
(Stearyl = CH3(CH2)16CO-) |
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細胞穿透肽 HIV TAT
細胞穿透肽（如HIV TAT）可以以直接穿透和内吞兩(liǎng)種(zhǒng)方式進(jìn)入細胞。HIV TAT或者簡單的多聚精氨酸可被(bèi)設計作爲有效的藥物載體，但CPP（如HIV TAT）是如何實現胞膜轉運，目前仍不清楚。
簡單的HIV TAT是如何促進(jìn)象直接穿透和内吞作用的入胞機制的呢？來自Gerard Wong實驗室的研究人員研究了在不同的條件下，HIV TAT是如何與細胞質膜、細胞骨架、特異的胞膜受體相互作用，從而誘導了多重轉運途徑。查看來自Gerard Wong實驗室的論文：http://bit.ly/zQrH6t.
有趣的是，TAT在不同條件下可與同一序列發(fā)生多種(zhǒng)不同的反應，因而與胞膜、細胞骨架、特異受體相互作用可産生多種(zhǒng)轉運途徑。
CPP的跨膜機制與多肽序列存在很敏感的關系，如果在一個純親水性的CPP中增加一個疏水殘基，就能(néng)徹底地改變其轉運機制，例如，最簡單的CPP原型-多聚精氨基（polyR），可以誘導細胞膜上形成(chéng)跨膜的孔隙結構。疏水氨基酸通過(guò)插入胞膜來形成(chéng)正曲率，精氨酸可同時形成(chéng)正曲率和負曲率，賴氨酸隻能(néng)沿一個方向(xiàng)形成(chéng)負曲率，這(zhè)就意味著(zhe)在精氨酸與賴氨酸/疏水物之間存在補償關系。
如果疏水性有助于形成(chéng)負高斯曲率（Gaussian curvature），那爲什麼(me)TAT肽中的疏水含量相對(duì)較低呢？其原因是CPPs都(dōu)是利用盡可能(néng)少的疏水基去形成(chéng)saddle-splay curvature。序列上的差異很可能(néng)隻會在膜上誘導短暫的類似孔隙的跨膜結構，從而形成(chéng)對(duì)CPP來說更短的孔隙壽命。由于CPP的氨基酸組成(chéng)不同，TAT肽在有或無受體情況下都(dōu)可以介導細胞内吞作用。 |
參考文獻:
Simeoni, F, Morris, MC, Heitz, F and Divita, G (2003). Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res 31: 2717–2724.
Tönges, L, Lingor, P, Egle, R, Dietz, GP, Fahr, A and Bähr, M (2006). Stearylated
octaarginine and artificial virus-like particles for transfection of siRNA into primary rat
neurons. RNA 12: 1431–1438.
Morris, MC, Vidal, P, Chaloin, L, Heitz, F and Divita, G (1997). A new peptide vector
for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. Nucleic Acids Res 25:
2730–2736.
Andaloussi, SE, Lehto, T, Mäger, I, Rosenthal-Aizman, K, Oprea, II, Simonson, OE et al.
(2011). Design of a peptide-based vector, PepFect6, for efficient delivery of siRNA in
cell culture and systemically in vivo. Nucleic Acids Res 39: 3972–3987.
Eguchi, A, Meade, BR, Chang, YC, Fredrickson, CT, Willert, K, Puri, N et al. (2009).
Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide transduction domain-dsRNA
binding domain fusion protein. Nat Biotechnol 27: 567–571.
Lundberg, P, El-Andaloussi, S, Sütlü, T, Johansson, H and Langel, Ű (2007). Delivery
of short interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating peptides. FASEB J 21:
2664–2671.
細胞穿透肽的合成(chéng)報價
- 方法一： 通過(guò)在線的報價系統
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